1.9. Изучение профиля генетического транскриптома при старении

Успехи в биотехнологии привели к разработке методов одновременного количественного определения относительной концентрации тысяч мРНК. Хотя экспрессия генов регулируется на нескольких уровнях, транскрипция является главной целью высокопроизводительного геномного анализа. Молекулярные методы анализа экспрессии на геномном уровне включают в себя секвенирование (определение нуклеотидной последовательности) экспрессированных секвенсных ярлыков (EST-секвенирование клонов кДНК, синтезированных из мРНК, представленной в клетке в момент анализа), субтрактивную гибридизацию (изоляция молекул мРНК/кДНК с помощью стратегии на основе субтрактивной гибридизации, с последующей идентификацией тех из них, которые по-разному представлены в двух сравниваемых образцах), дифференциальный дисплей (основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод идентификации мРНК, по-разному представленных в двух сравниваемых образцах), конкурентная ПЦР, кДНК или олигонуклеотидные микроарреи (микрочипы) (высокоплотные комплекты клонов кДНК или олигонуклеотидов, которые могут быть гибридизованы с мечеными пробами, синтезированными из тотальной мРНК образца), и серийный анализ генетической экспрессии (SAGE). Число транскриптов (молекул мРНК), которое может быть анализировано методами субтрактивной гибридизации, дифференциального дисплея или конкурентной ПЦР, является ограниченным, в то время как метод EST-секвенирования, позволяющий определить относительную частоту, с которой отдельные молекулы мРНК представлены в общем объеме мРНК в образце, требует чрезвычайно большого объема секвенирования, занимающего значительное время.

Два метода в настоящее время являются ведущими инструментами анализа экспрессии генов на геномном уровне. ДНК-микрочиповая технология (основанная на кДНК или олигонуклеотидах) позволяет получить количественную информацию о полном или близком к полному профиле транскрипции в исследуемых клетках (Young, 2000). С другой стороны, в то время как микрочиповая технология позволяет потенциально, одномоментно анализировать уровни экспрессии значительного числа генов, природа метода позволяет изучение только уже предварительно идентифицированных экспрессированных секвенсов. Серийный анализ генетической экспрессии, таким образом, является единственной технологией, которая способна в настоящее время количественно охарактеризовать полный транскриптиом, то есть совокупность мРНК, которая уже была, и еще не была идентифицирована в данном типе клеток или ткани (Velculescu et al., 1999; Anisimov, Boheler, 2003).

Открытие микрочиповой технологии как нового направления в молекулярной биологии привело к значительному прогрессу в понимании изменения экспрессии генов в тканях в ходе жизнедеятельности, как важнейшего фактора адаптации их к стрессорным влияниям окружающей среды. Значительный прогресс в технических аспектах создания микрочипов и в первую очередь мембранных микрочипов, сопровождавшийся минимизацией размеров и повышением точности нанесения биологического материала, позволил в течение буквально нескольких лет перейти от микрочипов, содержащих лишь десятки и сотни точек нанесения, к микрочипам, содержащим десятки тысяч таких точек (Suzuki et al., 2002). Для изучения экспрессии генов наибольшее распространение получили мембранные ДНК-микрочипы, а именно олигонуклеотидные и основанные на кДНК Использование олигонуклеотидных микрочипов, основанное на гибридизации образца с зафиксированными на мембранах синтезированными фрагментами ДНК (длиной от 20 до 50-60 пар оснований) позволяет добиться высокой точности и достоверности абсолютных значений гибридизации, но требуют высоких затрат на этапе синтеза ДНК, что ограничивает возможность использования таких микрочипов в крупномасштабных проектах. кДНК-микрочипы используют "библиотеки", то есть коллекции бактериальных клонов, содержащие в виде инсертов участки кДНК длиной обычно от 0.5 до 2.5 тыс. нуклеотидов, удобные в хранении и обработке. Аликвоты очищенной кДНК из десятков тысяч подобных бактериальных клонов с помощью высокоточной робототехники могут быть нанесены и зафиксированы на мембране в определенной последовательности. Хотя абсолютная точность гибридизационного сигнала является меньшей, чем для олигонуклеотидных микрочипов (из-за неодинаковой длины гибридизуемых фрагментов кДНК и ряда других показателей), такие микрочипы наиболее удобны для крупномасштабного скрининга генов, отвечающих изменением своей экспрессии на внешнее воздействие, такое как применение лекарственного препарата, дифференциация, патология и старение.

Серийный анализ генетической экспрессии (SAGE) - это молекулярная техника, позволяющая одномоментно количественно и качественно охарактеризовать экспрессию тысяч транскриптов (Velculescu et al.. 1999). Два основных принципа лежат в основе серийного анализа генетической экспрессии. Во-первых, короткие нуклеотидные последовательности ДНК (ярлыки) достаточны для идентификации индивидуальных генных продуктов и, во-вторых, конкатемеризация таких ярлыков (связывание их друг с другом в одну последовательность) многократно увеличивает эффективность идентифицирования экспрессированной мРНК в секвенируемых библиотеках. Профиль транскрипции, генерированный с помощью SAGE, полагается для идентификации и клонирования генов на нуклеотидные последовательности длиной 10-14 пар оснований (SAGE-ярлыки). Теоретически ярлык длиной 14 пар оснований, состоящий из составляющих любую ДНК четырех видов нуклеотидных оснований (А, Ц, Г и Т), может определить 4¹⁴ (268 435 456) разных транскриптов, что многократно превосходит число генов, предположительно содержащихся в геноме человека и млекопитающих (число которых, по разным оценкам, колеблется от 30 000-40 000 до 70 000- 140000). даже без наличия какой-либо предварительной информации об их нуклеотидном составе и экспрессии в изучаемом образце. Для создания несущего информацию о транскрипте ярлыка, поли(А) РНК (мРНК) изолируется и при помощи dT-праймера транскрибируется в двунитевую кДНК. Комбинация рестрикционных ферментов (якорного - фермент 1-го типа, и ярлыкового - фермент 2-го типа) позволяет вырезать из участка, соседнего с наиболее близким к поли(А) концу кДНК сайта рестрикции якорного фермента 14-нуклеотидный ярлык- Выделенные ярлыки конкатемеризуются, формируя цепочки, содержащие значительное количество ярлыков, клонируются, и их нуклеотидная последовательность может быть определена секвенированием. Нуклеотидная последовательность ярлыков затем сравнивается с нуклеотидными последовательностями известных генов и экспрессированных секвенсных ярлыков, находящимися в специализированных базах данных (Velculescu el al., 1999; Anisimov S. et al., 2002).

Несмотря на определенные сложности анализа полученного такими методами данных, связанные с различением эффектов собственно старения и методической и биологической вариабельностью, при изучении старения применяются два основных метода - серийный анализ генной экспрессии (SAGE) и ДНК микрочиповая технология (Welle, 2002; Anisimov, Boheler, 2003). Число исследований с применением этих методов стремительно растет. В табл. 9 приведены сведения о некоторых последних исследованиях по сравнению транскриптомов у молодых и старых животных и человека.

Несмотря на то что изменения уровня мРНК обычно ассоциированы с изменениями в уровне кодируемых белков, экспрессия некоторых белков регулируется, скорее, на трансляционном уровне, а не транскрипционном. Даже в тех случаях, когда концентрация белка контролируется генной траскрипцией, избыточность мРНК может не отражать изменения в специфической активности белка, вызванные возрастными изменениями в регулируемых ими пост-трансляционных модификациях (например, фосфорилировании), либо окислительными повреждениями (Welle, 2002). Полученные в опытах на мышах с помощью кДНК микрочиповой технологии данные свидетельствуют о том, что при старении имеет место активация адаптационного ответа на стресс, вызываемый увеличенным уровнем активных форм кислорода (АФК) (Weindmch et al., 2002). При изучении возрастной динамики экспрессии полного транскриптома нематоды было установлено, что увеличение активности генов ins-2 и ins-18 у старых нематод ответственно за снижение передачи сигнала инсулина и устойчивости к стрессу (Lund et al., 2002).

Дизайн сайта разработан KN Graphics