5.6. Клеточное старение и канцерогенез: роль теломер и теломеразы

Вопрос о соответствии клеточного старения in vitro и in vivo уже обсуждался в разделе 3.2. Этот аспект представляется принципиально важным, поскольку предполагается, что репликативное (клеточное) старение является механизмом, защищающим организм от рака, хотя этот же механизм накопления клеток на последних стадиях из репликативной жизни может быть ответственным за процесс старения и увеличение чувствительности к канцерогенам (Hayflick, 1998; Campisi et al., 2001). Следует заметить, что при успешной химиотерапии опухолей у мышей включается программа клеточного старения, контролируемая р53 и p16^INK4a, тогда как у мышей с перевитыми опухолями, имеющими дефект в механизме клеточного старения, ее эффективность значительно ниже и прогноз существенно хуже (Schmitt, 2003).

Соматические клетки животных некоторых видов (например, рыб) имеют иммортализированный фенотип, однако частота развития опухолей у них не отличается от других видов (Macieira-Coelho, 2001). С другой стороны, существуют как иммортизированные клеточные линии, в которых не удается обнаружить теломеразу (Bryan et al., 1995), так и стволовые клетки или нормальные соматические клетки, экспрессирующие теломеразу, в которых тем не менее при культивировании происходит укорочение теломер (Counter et al., 1995; Chiu etal., 1996).

Чувствительность к вызываемой канцерогенными агентами трансформации клеток на разных стадиях пролиферативного старения различается в зависимости от типа агента. Так, молодые клетки (находящиеся на ранних пассажах) более чувствительны к трансформации химическими канцерогенами и малыми дозами ионизирующей радиациии, чувствительность к действию ультрафиолетового облучения не изменяется на протяжении репликативной жизни фибробластов человека, тогда как чувствительность к опухолевым промоторам, идентичная в течение почти всей репликативной жизни клеток, увеличивается в финальной стадии, когда также максимальна чувствительность к трансформирующему действию вируса SV40 (Macieira-Coelho, 1994, 2001).

Фибробласты, полученные от взрослых крыс, были значительно чувствительнее к трансформации, индуцируемой онкогеном v-scr, чем эмбриональные клетки (Tavoloni, Inoue, 1997). Исследование роли организменных факторов старения в чувствительности первичных клеток т vitro к трансформирующему действию SV-LT показало, что она пропорциональна возрасту донора (Kunisada et al., 1990). Онкоген ras вызывает обусловленное индукцией р53 и р!6 преждевременное репликативное старение в первичных культурах клеток грызунов и человека (Serrano et al., 1997). Авторы полагают, что индукция преждевременного клеточного старения в ответ на аномальные митогенные сигналы представляет собой механизм подавления опухолевого роста. Инактивация такого антипролиферативного ответа способствует беспрепятственной пролиферации в присутствии онкогенного стимула. Эти наблюдения позволяют объяснить роль большой мутабельности участвующих в индуцируемом онкогенами клеточном старении генов р53 и р16 в процессе опухолевой прогрессии (Serrano et al., 2001). Индукция клеточного старения активными онкогенами, такими как ras, свидетельствует о том, что оно является программированным ответом клеток, который может запускаться не только по мере их удвоения, но и некоторыми пролиферативными стрессорами (Bringold, Serrano. 2000). Применение микрочиповой технологии для изучения связанных с репликативным старением генов в фибробластах кожи, пигментных клетках сетчатки и эндотелиальных клетках сосудов позволило установить, что характеристики репликативного старения весьма тканеспецифичны (Shelton et al., 1999). Так, в фибробластах экспрессируются провоспалительные гены, лишь в ограниченной степени перекрещивающиеся с характером генной экспрессии при старении in vitro двух других типов клеток.

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении роли теломер в старении. Дисфункция теломер, связана ли она с опосредованным делением клетки укорочением, прямым повреждением или ассоциированным с теломерой дефектным белком, может приводить к трем последствиям: клеточному старению, клеточной гибели (апоптозу) или нестабильности генома (Kim et al., 2002). Нестабильность генома является фактором, предрасполагающим к злокачественной трансформации клетки, тогда как клеточное старение и апоптоз играют роль факторов подавления неопластического процесса.

Клеточное старение рассматривают как один из защитных механизмов клетки при дисфункции теломер, поскольку оно останавливает пролиферацию, тем самым блокируя канцерогенез (Campisi et al., 2001; Kim et al., 2002; Krtolica, Campisi, 2003). В течение жизни в организме аккумулируются соматические мутации, некоторые из которых могут инактивировать гены, необходимые для клеточного старения (Dolle et al., 2000). Кроме того, потеря гетерозиготности и мутации в генах-супрессорах (р53 и Rb) и онкогенах (например, ras) может иметь место даже в нормальных клетках (Kim et al., 2002). Другим защитным механизмом клетки с дисфункцией теломер, в который вовлечен интактный р53, является апоптоз. В клетках, в которых накапливаются мутации в самом р53 или в других компонентах его регуляции, развивается нестабильность генома, во много раз повышающая вероятность злокачественной трансформации.

Потеря дистальных областей теломер коррелирует с уменьшением пролиферативной жизни клеток как in vitro, так и in vivo. Регрессионный анализ данных по укорочению длины теломер в 15 различных тканях человека показал, что скорость укорочения теломер составляет от 20 до 60 пар оснований в год (Takubo et al., 2002). Подчеркивается, что длина теломер не имеет четкой корреляции со временем обновления тканей ш vivo, а скорее является индивидуальной характеристикой организма.

В настоящее время активно развивается гипотеза о важной роли укорочения теломер и реактивации теломеразы соответственно в процессах старения и канцерогенеза (Campisi et al., 2001; Neidle, Parkinson, 2002). В опухолях человека иммортализация почти всегда обусловлена подавлением гена каталитической субъединицы теломеразы (hTERT). Подавление транскрипции hTERT в клетках человека in utero, посттранскрипционные и эпигенетические изменения в этом гене и, возможно, некоторые другие факторы, предотвращающие образование функционирующей теломеры, ответственны за "мортализацию" нормальных соматических клеток. Множественность механизмов, подавляющих или регулирующих активность теломеразы, может объяснить исключительную редкость спонтанной иммортализации нормальных клеток человека. С другой стороны, введение hTERT иммортализирует различные типы клеток человека без последующего развития опухолевого роста (Harley, 2002). Следует отметить, что в некоторых весьма злокачественных и метастазирующих опухолях, например нейробластоме, активность теломеразы не выявляется (Harley, 2002). Более того, показано, что трансфекция теломеразы в эпителиальные клетки, полученные от пациентов с синдромом Li Fraumeni, поддерживает длину теломер, увеличивает продолжительность репликативной жизни клеток и предотвращает их спонтанную иммортализацию (Elmore et ai., 2002).

Предполагается, что основная функция дикого типа супрессорного гена р53 состоит в запуске остановки роста в ответ на потерю теломер в старых клетках (Wynford-Thomas et al., 1995). Этой гипотезе не противоречат данные о поведении большинства опухолей, в которых этот ген мутирован, и объясняет существование и характеристики редких типов опухолей, в которых функция р53 сохранена.

Недавно было показано, что старые фибробласты человека стимулируют in vitro пролиферацию предраковых и злокачественных, но не нормальных эпителиальных клеток, которые способны образовывать опухоли при прививке голым мышам (Krtolica et al., 2001). В фибробластах, находившихся на более ранних пассажах (пресенильных), эта способность была менее выражена, чем у старых клеток. В какой-то мере этим наблюдениям in vitro соответствуют результаты некоторых опытов с эпителиальными опухолями, перевиваемыми подкожно животным разного возраста (см. табл. 34). Так, не наблюдалось различия в скорости роста перевиваемого плоскоклеточного рака шейки матки SCC мышам в возрасте 3 и 12 месяцев, однако у 18-месячных самок мышей эта опухоль росла значительно быстрее, чем у 3-месячных (Анисимов, Жуковская, 1981). Однако некоторые перевиваемые эпителиальные опухоли (меланома В16, спонтанная карцинома молочной железы, карцинома Уокера-256, гепатома Новикова) у старых реципиентов росли медленней, чем у молодых. Старый возраст оказывал промотирующее влияние на рост in vivo большинства перевиваемых сарком (Anisimov, 1987).

Было также отмечено, что молодые (то есть прошедшие менее 30 % своей репликативной жизни) стромальные клетки эндометрия, полученные от взрослых женщин, угнетают ассоциированные со злокачественностью свойства к независимой от подложки пролиферации клеток рака эндометрия человека, тогда как старые стромальные клетки (прошедшие более 90 % их репликативной жизни) теряли такую способность (Rinehart, Torti, 1997).

Следует подчеркнуть, что старение не является обязательным последствием пролиферации в культуре. Так, шванновские клетки крысы способны неограниченно пролиферировать in vitro, тогда как фибробласты, выделенные из тех же нервов, подвергаются классическому репликативному старению, свойственному фибробластам грызунов (Mathon et al., 2001). Было установлено, что эндотелиаль-ные клетки пупочной вены останавливаются в фазе G1 клеточного цикла, но, в отличие от фибробластов, подвержены возрастной тет-раплоидизации и апоптотической клеточной гибели, существенно отличаясь этим от резистентных к апоптозу фибробластов (Наmреl et al., 2002). Некоторые другие нормальные клетки-предшественники грызунов (например, олигодендроциты) обладают неограниченной способностью пролиферировать в культурах, из которых устранены факторы, ответственные за дифференцировку и запуск блокады клеточного цикла (Tang et al., 2001).

В противоположность фибробластам, эпителиальные клетки молочной железы человека спонтанно ускользают от старения, и в них развиваются генетические нарушения, которые необходимы для инициации канцерогенеза (Romanov et al., 2001). В этом исследовании на протяжении 75 пассажей были исследованы пролиферация, кариотип, длина теломер и уровень экспрессии генов р53, р21 и р14. Клетки, пережившие процесс отбора, теряли экспрессию р16, что коррелирует с их ускользанием от остановки роста. Затем в течение второй фазы экспоненциального роста в клетках начали появляться хромосомные нарушения. С этими данными согласуются наблюдения, свидетельствующие о том, что в эпителиальных клетках молочной железы имеет место прогрессивное укорочение теломер. В то же время уровни белков р53, его модулятора р14 и эффектора р21 увеличивались, что свидетельствует о том, что агонизирующие in vitro клетки молочного эпителия (термин, предложенный для различения от одного плато при старении фибробластов) эффективно регулируются р53. Эти наблюдения позволяют предположить, что в клетках эпителия молочной железы могут спонтанно возникать нарушения генома, необходимые для возникновения раковых клеток (Clevenger, 2001).

Хотя в протоковых карциномах молочной железы и их непосредственных предшественниках активность теломеразы увеличена, до настоящего времени не получены доказательства укорочения теломер в опухолевых клетках по сравнению с нормальными (Rha et al., J999). Полагают, что клеточное старение может не иметь места в некоторых типах эпителиальных клеток. Следует также заметить, что, несмотря на то что аргументы в пользу предположения о связи между репликативным старением клеток человека, биологией теломеры и раком человека довольно убедительны;, данные о роли репликативного старения в старении человека довольно противоречивы и требуют дальнейших исследований (Wright, Shay, 2000). В ряде работ под сомнение ставится как вопрос о соответствии старения in vivo клеточному старению in vitro, так и отношение вызываемого онкогенами клеточного старения к процессу канцерогенеза (Stewart, Weinberg, 2002).

Уменьшение межклеточных взаимодействий, осуществляемых через щелезые контакты, является важной чертой опухолевых клеток (Hanahan, Weinberg, 2000; Luzzatto, 2001). Уменьшение этих взаимодействий также наблюдается в старых эндотелиальных клетках человека (Xie, Ни, 1994). Уровень мРНК коннексина 42 и соответствующего белка также снижается в этих клетках при старении in vitro. Неспособность старых клеток угнетать щелевые контакты в ответ на добавление эпидермального фактора роста свидетельствует о дефекте в механизме, регулирующем активность щелевых контактов в старых клетках (Xie, Ни, 1994).

Выше уже упоминалось, что стволовые клетки не имеют никакого пролиферативного лимита in vivo (см. главу 3). Реально наблюдаемый феномен при старении in vivo - это уменьшение клеточной пролиферации, наблюдаемое в большинстве тканей лабораторных грызунов (Baserga, 1997; Anisimov, 1987; Rubin, 1997). При этом основным изменением является увеличение времени клеточного цикла и его вариабельности.

Дизайн сайта разработан KN Graphics