9.13.4 Влияние пептидных биорегуляторов на экспрессию генов

В целом ряде экспериментов, описанных выше, были получены данные, свидетельствующие о том, что при действии пептидных препаратов, представляющих собой смеси природных пептидов или отдельные сконструированные пептиды, в тканях организма происходят изменения экспрессии генов. Выдвинута гипотеза, что эффекты пептидов обусловлены их действием на уровне регуляции экспрессии генов (Морозов, Хавинсон, 1996). Для того чтобы исследовать такую возможность более подробно, был проведен эксперимент с применением техники ДНК микрочипов. В использованной модификации этот метод позволяет одновременно определять изменения экспрессии 15 247 генов. С его помощью были исследованы уровни мРНК в сердце мышей до и после введения эпиталона или вилона (Анисимов С. В. и др., 2002).

В опытах использовано 30 самок мышей линии СВА, которые получали стандартный лабораторный корм и питьевую воду без ограничений. В возрасте 6 месяцев мыши были случайным образом распределены в 3 группы по 10 особей. Мыши подопытных групп в течение 5 дней получали подкожные инъекции 1 мкг вилона или эпиталона, растворенных в 0.1 мл 0.9%-ного раствора NaCl. Животные контрольной группы получали подкожные инъекции 0.1 мл 0.9 %-ного раствора NaCl. На 6-й день все мыши были умерщвлены декапитацией на гильотине, сердца были извлечены и немедленно заморожены в жидком азоте и далее хранились при -80°С до этапа выделения тотальной РНК. В эксперименте были использованы 15 247 клонов, входящих в библиотеку кДНК, принадлежащую Национальному институту старения США (NIA mouse 15K. cDNA clone set).

В ходе эксперимента была проведена трипликативная гибридизация микрочипов, содержащих 15 247 клонов кДНК, с образцами ткани сердца мышей контрольной и подопытных групп. Было выявлено 300 клонов (1.94 % от общего числа) с более чем двукратным изменением уровня экспрессии в сердцах мышей подопытных групп по сравнению с мышами контрольной группы. Под воздействием только вилона изменялась экспрессия 36 клонов, под воздействием только эпиталона - 98 клонов и под воздействием обоих пептидов - 144 клона. Всего же под воздействием вилона изменялась экспрессия 180 клонов и под воздействием эпиталона - 242 клонов. При введении вилона отмечено изменение экспресии 157 клонов в сторону увеличения и 23 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием вилона по сравнению с контролем составило 6.13 раза, максимальное уменьшение -- 2.79 раза. Аналогично под воздействием эпиталона отмечено изменение экспрессии 194 клонов в сторону увеличения и 48 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием эпиталона по сравнению с контролем составило 6.61 раза, максимальное уменьшение - 2.71 раза.

Следует отметить, что при введении вилона или эпиталона менялась экспрессия 5 из 13 генов, кодируемых митохондриальным геномом. Для 4 митохондриальных генов (16S - вилон и эпиталон; НАДН-дегидрогсназа 4 и 5 и цнтохром В - только эпиталон) уровень экспрессии повышался в 2.03-6.61 раза, в то время как для гена АТФазы 6-й уровень экспрессии под воздействием вилоиа снижался в 2.25 раза.

139 ядерных генов были разбиты по категориям согласно функциональной классификации генов сердечно-сосудистой системы. 44 гена не вошли ни в одну из категорий либо являлись генами гипотетических белков. Остальные 95 генов представили все 6 основных функциональных категорий генов, в том числе гены клеточного деления (14 генов), клеточных сигнальных систем и коммуникаций (15 генов), клеточной структуры и подвижности (7 генов), защитных систем клетки и организма (16 генов), экспрессии генов и белков (24 гена), метаболизма (19 генов).

Гены, уровень экспрессии которых изменялся под воздействием вилона и эпиталона, функционально относятся к самым разным клеточным системам. При сравнении их распределения по функциональным категориям отмечено его несовпадение с нормальным распределением для генов, представленных в сердце. Гены клеточного деления и защитных систем клетки и организма представлены среди генов с измененным уровнем экспрессии значительно шире, чем в общей совокупности (10.07% в сравнении с 5.68% для категории клеточного деления; 11.51% в сравнении с 6.71% для категории защитных систем клетки и организма). Таким образом, можно предположить, что относящиеся к этим двум подклассам гены являются наиболее значимыми эффекторами биологического действия вилона и эпиталона. Более детальный анализ функциональных подкатегорий показал, что наиболее значимыми являются изменения доли генов, имеющих отношение к регуляции клеточного цикла (подкатегория 1d: 5 генов - 3.6% против 1.59% в общей совокупности), мембранного транспорта/транспортных белков (подкатегория 4bЗ: 6 генов - 4.32 % против 0.9 %) и иммунной системы (подкатегория 4с: 5 генов - 3.6% против 1.75 %). При сравнении влияния вилона и эпиталона на гены, представленные в сердце, была обнаружена относительная избирательность воздействия эпиталонз на уровень экспрессии генов, имеющих отношение к рибосомальным белкам (подкатегория 5bЗ). Вилон увеличил экспрессию лишь одного гена данной подкатегории - киназы 1 рибосомальной РНК S6 (р70/р85 86-киназы), в то время как эпиталон, кроме 86-кинази. в 2.02-2.46 раза увеличил экспрессию генов рибосомальных белков L8, L27 и РНК S6 и S10 Существенно, что ген рибосомальной РНК S10 был представлен двумя клонами, имевшими сходство с нуклеотидными последовательностями гена крысы и человека и продемонстрировавшими почти одинаковое увеличение уровней экспрессии (в 2.02 и 2.09 раза соответственно).

Важным представляется влияние вилона и эпиталона на изменение уровня экспрессии нескольких генов, имеющих отношение к он-когенезу. Обнаружено уменьшение уровня экспрессии гена, сходного с онкогеном миелобластоза (вилон) и протоонкогена Bcl-3 (эпиталон). Пептиды увеличивают уровень экспрессии генов протеинкиназы C-zeta (эпиталон), LIM/PDZ-доменных белков Энигма (эпиталон), его гомолога 2 (оба пептида), которые, как полагают, также вовлечены в онкогенез и уменьшают экспрессию функционально связанного с последними гена PDZ-доменного белка Cipp (вилон).

Также обращает на себя внимание влияние пептидов на большое число генов, имеющих отношение к обмену кальция, в частности на ген куллина-5, гены Ксnn4 и Dcamkll (экспрессия увеличивается обоими пептидами), кальмодулин (экспрессия увеличивается эпиталоном), и гены Са-связывающего белка кальбайндина и Ксnn2 (экспрессия уменьшается эпиталоном). Кроме того, в той же функциональной категории (клеточные сигнальные системы и коммуникации) обнаруживаются гены трех серин/треониновых киназ (Pctk3, FUSED, Stkl)), экспрессия которых увеличивается под воздействием обоих пептидов. По крайней мере одна из этих киназ (Stkl 1), функция которой неясна, обладает антиканцерогенными свойствами, и мутации ее гена приводят к развитию синдрома Пейтца-Егерса, сопровождающегося высоким риском развития опухолей многих локализаций, эти данные согласуются с нашими наблюдениями об угнетающем влиянии эпиталона и вилона на развитие спонтанных опухолей.

Таким образом, установлена возможность специфического влияния пептидных биорегуляторов эпиталона и вилона на экспрессию генов. Вместе с тем ясно, что в опытах в условиях целостного организма in vivo практически невозможно определить, является ли действие исследуемого фактора на данный орган прямым, или оно опосредовано прямым действием на какие-то другие органы и влиянием уже с их стороны на исследуемый орган. В частности, выше приводились факты, свидетельствующие о влиянии эпиталона и вилона на нейроэндокринную и иммунную системы, поэтому нельзя исключить возможность того, что продемонстрированные изменения экспрессии генов в сердце вызваны изменениями гормонального фона, состояния ДНЭС или секреции лимфокинов. В этой связи важно, что было показано прямое влияние вилона на экспрессию гена интерлейкина-2 в лимфоцитах (Khavinson, 2002).

Следует отметить, что при изучении влияния вилона и эпиталона на экспрессию генов получены данные об избирательном действии этих пептидов на гены, продукты которых участвуют в кальциевом гомеостазе клеток и реализуют эффекты ионов кальция, считающихся одним из важнейших компонентов систем внутриклеточной передачи сигналов. Еще один тип механизмов внутриклеточной передачи сигналов основан на протеинкиназных каскадах. В этой связи привлекают внимание данные о влиянии эпиталона на экспрессию генов некоторых серин-треониновых киназ. Кроме того, показано влияние эпиталона на экспрессию одной из протеинкиназ С, принимающих участие в фосфоинозитопьном пути передачи внутриклеточных сигналов.

В списке генов, экспрессия которых в сердце меняется при введении пептидных препаратов, привлекают внимание те, что имеют отношение к митохондриям. Самое сильное повышение экспрессии, какое наблюдалось при ведении как эпиталона, так и вилона (6.1 и 6.6 раза соответственно), произошло у митохондриального гена, кодирующего 165-субъединицу митохондриальных рибосом. Кроме того, только при введении эпиталона наблюдалось усиление экспрессии еще трех митохондриальных генов (в 2-2.3 раза), кодирующих цитохром b и компоненты ND4 и ND5 НАДН-дегидрогеназы (митохондриального комплекса I). Таким образом, эпиталон усиливает экспрессию четверти митохондриальных генов, кодирующих белки. Кроме того, только эпиталон усиливает экспрессию пяти ядерных генов из числа кодирующих митохокдриальные белки, а именно одну из субъединиц НЛДН-убихинон оксидоредуктазы (входящей в состав комплекса I), - и -субъединицы АТФ-синтетазы, НАД-зависимую изоцитратдегидрогеназу и додеценоил-КоА-изомеразу. И эпиталон, и вилон увеличивают экспрессию гена еноилгидратазы. Следует отметить, что перечисленные продукты генов лимитируют интенсивность процессов, в которых они участвуют. В целом изменения экспрессии генов, происходящие при введении эпиталона, затрагивают все основные биоэнергетические функции митохондрий: цикл Кребса и окисление жирных кислот, а также транспорт электронов по дыхательной цепи и синтез АТФ. От соотношения интенсивностей этих процессов зависит не только продукция АТФ, но и образование активных форм кислорода. Обе эти стороны функциональной активности митохондрий имеют прямое отношение к старению. При старении происходит преимущественное накопление делеций в митохондриальном геноме, что связано как с близостью источников активных форм кислорода к митохондриальной ДНК, так и с особенностями механизма репарации ДНК в митохондриях. Результатом этих мутаций являются нарушения функций митохондрий, приводящие к снижению продукции АТФ и усилению образования активных форм кислорода. В головном мозге, который характеризуется самым высоким уровнем аэробного обмена, сочетание дефицита АТФ с усилением свободнорадикальных процессов повышает вероятность развития возрастных нейродегенера-тивных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона (Harman, 1994).

С другой стороны, установлена способность эпиталона угнетать интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях организма. Получены данные, свидетельствующие о том, что после воздействия эпиталона на личинок дрозофил снижаются показатели интенсивности свободнорадикальных процессов в митохондриях, выделенных из взрослых мушек (Khavinson, 2002). Выше отмечалось, что общность эффектов, наблюдаемых при введении эпиталона млекопитающим и при обработке эпиталоном личинок дрозофил, может объясняться влиянием эпиталона на транскрипционные факторы, в частности тс, от которых зависит экспрессия генов, кодирующих ключевые ферменты синтеза мелатонина. Известно, что мелатонин обладает собственными антиоксидантными свойствами и индуцирует ферменты антиоксидантной защиты. Ряд данных указывает на то, что мелатонин может защищать от развития болезни Альигеймера и болезни Паркинсона (Reiter et al., 2002). Показано, что мелатонин избирательно накапливается в митохондриях, усиливает функциональную активность комплексов I и IV, предотвращает их повреждение, вызванное химическими агентами, которые индуцируют развитие паркинсонизма, и влияет на экспрессию митохондриальных генов. В частности, продемонстрировано усиление экспрессии гона цитохрома b, причем предполагается, что оно является проявлением тотальной активации митохондриального генома при действии мелатонина (Rciter et al.; 2002).

Таким образом, наиболее вероятной причиной увеличения экспрессии митохондриальных генов при введении эпиталона является усиление секреции мелатонина. Вместе с тем не исключено, что вышеуказанные изменения экспрессии ядерных генов митохондриальных белков может быть результатом прямого действия эпиталона.

Все пептидные биорегуляторы, для которых продемонстрирована их способность увеличивать продолжительность жизни, улучшают иммунитет. В случае эпиталамина и эпиталона она, скорее, связана с влиянием этих биорегуляторов на эпифиз, продукты которого в свою очередь могут стимулировать иммунитет. Таким же образом могут объясняться нейроэндокринные и антиоксидантные эффекты этих двух препаратов. Усиление иммунитета, оптимизация нейроэндокринных функций и ингибировиние свободнорадикальных реакций могут создавать основу для противоопухолевого действия. Снижение частоты возникновения опухолей является существенным фактором увеличения средней продолжительности жизни у лабораторных мышей и крыс, которым свойственна высокая предрасположенность к раковым заболеваниям. Усиление антиоксидантной активности само по себе способствует увеличению продолжительности жизни. На продолжительности жизни может положительным образом сказываться оптимизация нейроэндокринных регуляторных механизмов.

Дизайн сайта разработан KN Graphics