|
|
Robert A. Freitas Jr., ведущий исследователь IMM
Компилятивный перевод Свидиненко Юрия, ICM, © Immortality Corp.
В октябре 1999, ведущий ученый IMM (института по молекулярному произвдству IMM) Robert A. Freitas Jr. опубликовал первый том "Наномедицины", своей фундаментальной технической работы о применении молекулярной нанотехнологии в медицине. Эта статья, написанная им как отчет работы IMM основана на материалах, составляющих второй и третий тома "Наномедицины".
Внешние поверхности многих медицинских нанороботов [1] и нанокомплексов могут быть изготовлены из алмаза. Вот почему биосовместимость алмазных и алмазоидных (алмазоид - комбинация структуры алмаза с различными примесями и добавками (S, B, N), внесенными искусственно для получения новых свойств используемого материала - прим. перев.) частиц представляет интерес для наномедицины [2]. Некоторые наномедицинские устройства не нуждаются в адгезивных поверхностях, однако другие устройства, требующие тесной интеграции в ткани человека, могут нуждаться в полной химико-биоогической совместимости и интеграции с тканями, используя биосовместимые поверхности со специально разработанной биоактивностью на клеточном уровне. Такие поверхности, возможно, будут содержать наноупорядоченные, или, этактичные (от греческого eu tacticos - "хорошо организованный") материалы для беспрепятственной работы в клеточном окружении. Алмазные поверхности атомарной точности еще не изготовлены, поэтому нельзя доподлинно исследовать реакцию клеток на них. Однако биосовместимость сравнительно грубой поверхности из алмаза была проверена экспериментально в связи с предложенным недавно алмазным покрытием в ортопедических протезах. Биосовместимость такого изделия из алмаза была проверена клинически [3]. В этой статье я остановлюсь на одной очень близкой, но, тем не менее, очень важной проблеме алмазной биосовместимости: клеточная реакция на алмазные структуры и частицы.
Первая разработка клеточной реакции на алмазные поверхности была проведена Томсоном и его коллегами [4] в 1991, используя тканевую культуру, живущую совместно с алмазоподобным углеродом (АПУ) толщиной 0.4 микрона. АПУ - аморфный гидрокарбонатный полимер с химическими связями алмазного типа, т.е. образующими алмаз вместо обычного графита [5], и, поэтому АПУ обладает многими полезными свойствами алмаза [6]. Мышиные фибробласты росли на АПУ - поверхности 7 дней. При этом не было выявлено синтеза лактата дегидрогеназы (этот энзим обычно синтезируется живыми тканями при их повреждении, и способствует окислению лактазы). Это показывает, что целостность клеток, растущих на АПУ - поверхности, не была нарушена.
Мышиные брюшинные макрофаги, также культивированные на АПУ - покрытии, показали схожие параметры по синтезу лактата дегидрогеназы (или лизосомного энзима бета N-ацетил-D-глюкозаминидазы, который синтезируется макрофагами при их повреждении). Морфологические исследования не показали физического повреждения ни фибробластов ни макрофагов, подтверждая биохимическую индикацию об отсутствии токсичных либо воспалительных реакций in vitro. Дальнейшие изыскания [7] в 1994-95 показали, что мышиные макрофаги, человеческие фибробласты и остеобласт-подобные клетки, растущие на АПУ - покрытиях, развиваются нормально без изменений в цитологии или морфологии in vitro. Последующие эксперименты полностью подтвердили эти ранние результаты. Например, человеческие миелобласты ML-1 cells и зародышевые клетки почек в течении долгого времени развивались на АПУ - пленке, показав при этом высокую жизнеспособность и нетоксичность [8]. Сканирующая электронная микроскопия, использованная для изучения морфологического поведения остеобластов, показала, что клетки размножались нормально, без явного ухудшения клеточной физиологии. Когда же клетки помещали на кремниевые пленки, то клетки были жизнеспособны, но не способны к размножению [9]. Клетки человеческой остеогенной саркомы T385 и фибробласты 1BR3, культивируемые на АПУ-покрытии, также показали биосовместимость с ним [10].
Цитотоксические исследования АПУ - покрытий, проведенные Паркером и коллегами [11], используя тест на цитотоксичность "Kenacid Blue" in vitro на мышиных фибробластах, показали нормальный рост клеток на алмазных поверностях. Другие тесты на биосовместимость "аморфного гидрокарбона", выполненные этой командой на стандартном ряде клеток показали, что пленки такого типа нетоксичны для клеток, так как клетки нормально растут и размножаются.
Дайан [13] исследовал цитотоксичность и гемосовместимость АПУ - поверхностей на клонированных клетках 3T3 Balb/c и на эндотелиальных клетках человека, изолированных от плаценты. Никаких негативных эфектов в продуктах метаболизма обнаружено не было.
О'Лири и коллеги [14] оценили цитотоксичность и адгезию клеток мышиных фибробластов, растущих на сплаве титана и АПУ (содержание АПУ составило около 1 % ото всей площади). Были получены результаты нормальной адгезии клеток и их распределения на АПУ - поверхности.
Джонс и коллеги [15] разместили АПУ - покрытие (с помощью химически - парового размещения, ведомого плазмой (CVD)) на субстрате из титана и провели ряд тестов на гемосовместимость, тромбогенность и взаимодействие с тромбоцитами крови кролика. АПУ - покрытие не спровоцировало гемолитического эффекта, активации тромбоцитов или тенденции к формированию тромба. Распределение тромбоцитов на пленке происходило согласно ее поверхностной энергии.
Наконец, эксперимент Танга и его коллег [16]. Они изучали присоединение нейтрофилов к пленке АПУ, нанесенную плазменным методом (CVD). Площадь пленки составила ~1 cm2 при толщине в 350 микрон. Консервация на один час очищенных человеческих нейтрофилов концентрацией 2 x 106 клеток /см3 произвела присоединение ~400,000 клеток/см2 (~0.004 клеток/микрон2), такое же, как и для нержавеющей стали марки 316 stainless steel и в 40% меньшее, чем для титана; оба металла используются в настоящее время для имплантантов. Фотографии матрицы CVD - АПУ, имплантированной живой мыши на одну неделю, сделанные сканирующим электронным микроскопом (СЭМ), не показали минимальных признаков воспаления.
Интересно заметить, что на "грубо" полированной поверхности (с неровностями порядка ~1 микрона) небольшое количество распределенных по поверхности макрофагов (диаметром 10-13 микрон) проявляло активность и жизнеспособность. Однако, на гладкой неотполированной поверхности с шероховатостями <0.25 микрона, клетки (размерами 4-7 микрон), размещенные на ней, не образовывали псевдоподий или клеточных мостиков. Авторы [16] заметили, что "морфология неотполированных поверхностей CVD АПУ способствует активации поверхностно - присоединяющихся клеток, [но] механизм этого различной реакции клеток-фагоцитов пока непонятен." Если поверхностная шероховатость [17], топография [18], или кристаллическая структура [19] могут вызывать различную реакцию макрофагов, то вполне возможно, что использование алмазных поверхностей, изготовленных с атомной точностью, позволит большинству медицинских нанороботов (и рабочим наноорганам) быть полностью макрофаг-пассивными.
Результаты исследований, проводимых над различными биоматериалами показали [20], что "объемные", цельные формации материала могут безболезненно восприниматься организмом, в то время как частицы того же материала могут вызывать ракообразование (проводились соответствующие тесты на животных). Различие в размерах частиц вызывает гистологическую реакцию (воспаление тканей) [22]. Многие наномедицинские инструменты могут состоять из большого количества "алмазних частиц", то есть, нанороботов микронного раз мера, поэтому изучение реакции на алмазне частицы со стороны различных клеток организма представляет особый интерес. Мы знаем, что хорошо измельченные углеродные частицы хорошо усваиваются телом - пассивное поведение углерода в тканях было известно еще давно. Древесный уголь и копоть (сферические частицы диаметром 10-20 нм) использовались для татуировки с древнейших времен. Неизвестно другое: будут ли алмазные частицы приниматься клетками?
(1) Нейтрофилы. Сообщение в 1982 о возможной активации нейтрофилов на 2-8 микронные кристалы аморфного алмаза [23] еще не подтверждалось. Традиционно считалось, что алмазные частицы не вызывают воспаление и биологически инертны [24]. Например, Хеденборг и Клокарс в своих тестах [25] использовали алмазную пыль диаметром 4-8 микрон на проверку ее инертности, и обнаружили, что она не вызывает окислительного метаболизма полиморфоядерными (ПМЯ) лейкоцитами (наличие которого свидетельствует о воспалении или поражении легочных тканей). Тсе и Пхелпс [24] обнаружили, что кристаллическая алмазная пыль диаметром 3 микрона с концентрацией 2 мг/см3 (~0.06% Nct или "нанокрит" [2]; объемная концентрация), была фагоцитирована 21% всех ПМЯ, присутствующих в концентрации 7250 клеток/мм3 за 45 минут, но никакой хемотактичной активности фагоцитов на частицы не наблюдалось. Хиггсон и Джонс [26] выдерживали нейтрофилы лошади и свиньи на ряде кристаллических структур (гидроксиапатит, пирофосфат и др., вызывающие воспаление), которые индуцируют производство перекисей в зависимости от концентрации и температуры. Но выдерживая нейтрофилы на кристаллической структуре алмаза при 37 градусах цельсия подобного эффекта обнаружено не было. До сих пор другие эксперименты [27], проверяющие способность различных кристаллов вызывать фагоцитоз, дегрануляцию и факторы клеточного перемещения ПМЯ лейкоцитов, показали, что кристаллы гидроксиапатита (ГА) вызывают стимуляцию некоторых энзимов. Но алмазные кристаллы размером 4-8 микрон в суспензии ~0.2% Nct, взаимодействуют с ПМЯ лейкоцитами без выделения последними энзимов и стимуляций факторов передвижения клеток, даже при высокой концентрации частиц.
(2) Моноциты и Макрофаги. Известно, что свободный углерод и алмазные частицы поглощаются макрофагами без вредных эффектов. Например, клетки, поглощающие большие частицы алмазной пыли 2-4 микрона в диаметре, остаются здоровыми в течении, как минимум, 30 часов, в то время как клетки быстро гибли при фагоцитозе частиц кремнезема [28]. Энзим фосфатаза (продуцируемый соответствующими лизосомами), попадая в фагоцитозные пузырьки с алмазной пылью, не попадает в цитоплазму и ядро клетки. В более фундаментальной работе [29], 2-15 микронные частицы алмаза, карбида кремния (SiC), гидроксиапатита (ГА) и полиметилметакрилата (ПMMA), добавлялись к культурам (свободным от сыворотки) человеческих моноцитов в концентрации 0.5 мг/см3 (~0.01% Nct). Все частицы были фагоцитированы. Но морфология моноцитов при фагоцитозе алмазных частиц не изменялась, как это случалось при фагоцитозе ПММА, ГА и SiC. Производство 1-бета-интерлейкина было одинаково и для "управляющих" кристаллов, и для алмазных, но свыше 30-ти часов культуры на ГА гибнут, на SiC через 38 часов, на ПММА тоже через 38 часов. Авторы решили [29], что алмазные частицы в культурах моноцитов, свободных от сыворотки, инертны, в отличие от других кристаллических структур.
(3) Фибробласты. Ранние исследования в 1950х [30] и 1960х [28] показали, что алмазная пыль микронного размера не вызывает фиброгенной реакции. Шмидт и коллеги [31] заметили, что алмазная пыль нефибриногенна для человеческих моноцитов-макрофагов, обитающих в легких; другими словами, фибробласты не вызываются макрофагами в ответ на присутствие алмазной пыли. Алмазная пыль размерами <0.5 микрон и 1-2 микрона не вызывает распространение фибробластов даже при концентрации фибробластов ~0.1 мг/см3 (~0.003% Nct) [31]. В других экспериментах [32], синтетические ГА кристаллы с концентрацией 50 микрограмм/см3 в 1% и 10% содержанием сыворотки, стимулировали производство 3H тиминида в культурах фибробластов собаки и человеческой крайней плоти. Кристаллы пирофосфата дигидрата кальция также вызывают распространение фибробластов, но менее активно, чем отдельные кристаллы кальция или соды. Но кристаллы алмаза размерами 1-5 микрон не вызывают этого эффекта даже при концентрации частиц до 0.4 мг/см3 (~0.01% Nct).
(4) Другие клетки. Фагоцитозные реакции тканей костей кролика были изучены [33] путем имплантации различных частиц, растворенных в специальном составе (hyaluronan) в костный канал. Ткани, попадавшие впоследствии в костный канал, на протяжении 3 недель, были фагоцитированы клетками костной ткани. Частицы из высокоплотного полиэтилена, кусочки цемента и хром-кобальта были внедрены в костную ткань, но вызывали воспаление. А 2-15 микронные частицы алмаза, которые могли бы быть фагоцитированы, концентрацией ~60 миллионов/см3 (~0.7% Nct), не спровоцировали никаких заболеваний в костной ткани, и, видимо, "вели себя нейтрально:не было никаких неожиданных клеточных реакций на частицы" Гистологически, алмазные частицы собрались в группы. Случайные макрофаги присутствовали в культуре, но фагоцитарные клетки, содержащие в себе агрегированные частицы алмаза, были рассеяны по всей культуре; концентрация макрофагов и гигантских клеток была невелика. То же обнаружилось при имплантации ПММА. В конце концов, алмаз никогда не проявлял себя нейротоксически [34].
(5) Воспаление и гемолизис. Тсе и Пхелпс [24] открыли, что 3х микронные алмазные кристаллы с концентрацией 10 мг/см3 (~0.3% Nct), инъектированные в собачьи суставы, вызывают "небольшую воспалительную реакцию" - внутрисуставное давление оставалось, по прежнему, низким, как и количество клеток-фагоцитов. Исследования, проводимые Дионом и коллегами, [35] показали отсутствие гемолизиса in vitro при имплантации в кровь различных частиц (керамические пудры, включая алмаз, графит, алюминий) с концентрацией ~0.5 г / см3 в разбавленной крови. Эксперимент длился 60 минут.
Как видим, алмаз чрезвычайно биосовместим с живыми клетками.
Robert A. Freitas Jr., "Exploratory Design in Medical Nanotechnology: A Mechanical Artificial Red Cell," Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobil. Biotech. 26(1998):411-430. See also: http://www.foresight.org/Nanomedicine/Respirocytes.html.
Robert A. Freitas Jr., Nanomedicine, Volume I: Basic Capabilities, Landes Bioscience, Austin TX, 1999.
G. Dearnaley, "Diamond-like carbon: a potential means of reducing wear in total joint replacements," Clin. Mater. 12(1993):237-244; R. Lappalainen, A. Anttila, H. Heinonen, "Diamond coated total hip replacements," Clin. Orthop. 352(July 1998):118-127; M.B. Guglielmotti, S. Renou, R.L. Cabrini, "A histomorphometric study of tissue interface by laminar implant test in rats," Int. J. Oral Maxillofac. Implants 14(July-August 1999):565-570; S. Santavirta, M. Takagi, E. Gomez-Barrena, J. Nevalainen, J. Lassus, J. Salo, Y.T. Konttinen, "Studies of host response to orthopedic implants and biomaterials," J. Long Term Eff. Med. Implants 9(1999):67-76.
L. Anne Thomson, Frances C. Law, Neil Rushton, J. Franks, "Biocompatibility of diamond-like carbon coating," Biomaterials 12(January 1991):37-40.
J. Robertson, "Deposition mechanisms for promoting sp3 bonding in diamond like carbon," Diam. Rel. Mat. 2(1993):984-989; "Deposition of diamond-like carbon," Phil. Trans. Roy. Soc. A 342(15 February 1993):277-286.
J. Robertson, "Mechanical properties and structure of diamond-like carbon," Diam. Rel. Mat. 1(1992):397-406; "Properties of diamond-like coatings," Surface and Coating Technol. 50(14 February 1992):185-203.
M. Allen, F.C. Law, N. Rushton, "The effects of diamond-like carbon coatings on macrophages, fibroblasts and osteoblast-like cells in vitro," Clin. Mater. 17(1994):1-10; M.J. Allen, B.J. Myer, F.C. Law, N. Rushton, "The growth of osteoblast-like cells on diamond-like carbon (DLC) coatings in vitro," Trans. Orthop. Res. Soc. 20(1995):489 et seq; R. Butter, M. Allen, L. Chandra, A.H. Lettington, et al, "In vitro studies of DLC coatings with silicon intermediate layer," Diam. Rel. Mat. 4(1 May 1995):857-861.
L. Lu, M.W. Jones, R.L. Wu, "Diamond-like carbon as biological compatible material for cell culture and medical application," Biomed. Mater. Eng. 3(Winter 1993):223-228.
C. Du, X.W. Su, F.Z. Cui, X.D. Zhu, "Morphological behaviour of osteoblasts on diamond-like carbon coating and amorphous C-N film in organ culture," Biomaterials 19(April-May 1998):651-658.
Joseph Franks, Dudley Finch, "Medical applications of diamond-like carbon coatings," in Richard R.H. Coombs, Dennis W. Robinson, eds., Nanotechnology in Medicine and the Biosciences, Gordon and Breach Publishers, The Netherlands, 1996, pp. 133-138.
.L. Parker, K.L. Parker, I.R. McColl, D.M. Grant, J.V. Wood, "The biocompatibility of low temperature diamond-like carbon films: a transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and cytotoxicity study," Diam. Rel. Mat. 3(1994):1120-1123.
I.R. McColl, D.M. Grant, S.M. Green, J.V. Wood, et al, "Low temperature plasma assisted chemical vapour deposition of amorphous carbon films for biomedical polymeric substrates," Diam. Rel. Mat. 3(January 1994):83-87.
I. Dion, X. Roques, C. Baquey, E. Baudet, B. Basse Cathalinat, N. More, "Hemocompatibility of diamond-like carbon coating," Biomed. Mater. Eng. 3(Spring 1993):51-55; I. Dion, C. Baquey, J.R. Monties, "Diamond: the biomaterial of the 21st century?" Int. J. Artif. Organs 16(September 1993):623-627; I. Dion, L. Bordenave, F. Lefebre, et al, "Physicochemistry and Cytotoxicity of ceramics Part II: Cytotoxicity of ceramics," J. Mater. Sci.: Materials in Medicine 5(1994):18-24.
A. O'Leary, D.P. Dowling, K. Donnelly, T.P. O'Brien, T.C. Kelly, N. Weill, R. Eloy, "Diamond-like carbon coatings for biomedical applications," Key Engineering Materials 99-100(1995):301-308.
M.I. Jones, I.R. McColl, D.M. Grant, K.G. Parker, et al, "Haemocompatibility of DLC and TiC-TiN interlayers on titanium," Diam. Rel. Mat. 8(March 1999):457-462.
L. Tang, C. Tsai, W.W. Gerberich, L. Kruckeberg, D.R. Kania, "Biocompatibility of chemical-vapor-deposited diamond," Biomaterials 16(1995):483-488.
R. Kornu, W.J. Maloney, M.A. Kelly, R.L. Smith, "Osteoblast adhesion to orthopaedic implant alloys: effects of cell adhesion molecules and diamond-like carbon coating," J. Orthop. Res. 14(November 1996):871-877.
P. Clark, P. Connolly, Adam S.G. Curtis, J.A.T. Dow, Chris D.W. Wilkinson, "Cell guidance by ultrafine topography in vitro," J. Cell Sci. 99(May 1991):73-77; I. Nagata, A. Kawana, N. Nakatsuji, "Perpendicular contact guidance of CNS neuroblasts on artificial microstructures," Development 117(January 1993):401-408; A. Rajnicek, S. Britland, C. McCaig, "Contact guidance of CNS neurites on grooved quartz: influence of groove dimensions, neuronal age and cell type," J. Cell Sci. 110(December 1997):2905-2913.
Y. Harada, J.T. Wang, V.A. Doppalapudi, A.A. Willis, M. Jasty, W.H. Harris, M. Nagase, S.R. Goldring, "Differential effects of different forms of hydroxyapatite and hydroxyapatite/tricalcium phosphate particulates on human monocyte/macrophages in vitro," J. Biomed. Mater. Res. 31(May 1996):19-26.
J.C. Heath, M.A.R. Freeman, S.A.V. Swanson, "Carcinogenic properties of wear particles from prostheses made in cobalt-chromium alloy," Lancet 1(20 March 1971):564-566; H.G. Willert, G.H. Buchhorn, M. Semlitsch, "Particle disease dur to wear of metal alloys. Findings from retrieval studies," in B.F. Morrey, ed., Biological, Material and Mechanical Considerations of Joint Replacement, Raven Press, New York, 1993, pp. 129-146.
S.B. Goodman, V.L. Fornasier, J. Lee, J. Kei, "The histological effects of the implantation of different sizes of polyethylene particles in the rabbit tibia," J. Biomed. Mater. Res. 24(1990):517-524.
A.S. Shanbhag, J.J. Jacobs, J. Black, J.O. Galante, T.T. Grant, "Macrophage/particle interactions -- effect of size, composition and surface area," J. Biomed. Mater. Res. 28(1994):81-90.
I. Spilberg, J. Mehta, L. Simchowitz, "Induction of a chemotactic factor from human neutrophils by diverse crystals," J. Lab. Clin. Med. 100 (September 1982):399 404.
R.L. Tse, P. Phelps, "Polymorphonuclear leukocyte motility in vitro. V. Release of chemotactic activity following phagocytosis of calcium pyrophosphate crystals, diamond dust, and urate crystals," J. Lab. Clin. Med. 76(September 1970):403-415.
Mikael Hedenborg, Matti Klockars, "Quartz-Dust-Induced Production of Reactive Oxygen Metabolites by Human Granulocytes," Lung 167(1989):23-32.
F.K. Higson, O.T. Jones, "Oxygen radical production by horse and pig neutrophils induced by a range of crystals," J. Rheumatol. 11(December 1984):735-740.
A. Swan, B. Dularay, P. Dieppe, "A comparison of the effects of urate, hydroxyapatite and diamond crystals on polymorphonuclear cells: relationship of mediator release to the surface area and adsorptive capacity of different particles," J. Rheumatol. 17(October 1990):1346-1352.
A.C. Allison, J.S. Harington, M. Birbeck, "An Examination of the Cytotoxic Effects of Silica on Macrophages," J. Exp. Med. 124(1966):141-154.
L. Nordsletten, A.K. Hogasen, Y.T. Konttinen, S. Santavirta, P. Aspenberg, A.O. Aasen, "Human monocytes stimulation by particles of hydroxyapatite, silicon carbide and diamond: in vitro studies of new prosthesis coatings," Biomaterials 17(August 1996):1521-1527.
H.G. Luhr, "Comparative studies on phagocytosis of coal powders of various carbonification grades, also of quartz and diamond powders in tissue cultures," Arch. Gewerbepath. 16(1958):355-374.
J.A. Schmidt, C.N. Oliver, J.L. Lepe-Zuniga, I. Green, I. Gery, "Silica-stimulated monocytes release fibroblast proliferation factors identical to interleukin 1. A potential role for interleukin 1 in the pathogenesis of silicosis," J. Clin. Invest. 73(May 1984):1462-1472.
H.S. Cheung, M.T. Story, D.J. McCarty, "Mitogenic effects of hydroxyapatite and calcium pyrophosphate dihydrate crystals on cultured mammalian cells," Arthritis Rheum. 27(June 1984):668-674.
Per Aspenberg, Asko Anttila, Yrjo T. Konttinen, Reijo Lappalainen, Stuart B. Goodman, Lars Nordsletten, Seppo Santavirta, "Benign response to particles of diamond and SiC: bone chamber studies of new joint replacement coating materials in rabbits," Biomaterials 17(April 1996):807-812.
Stephen S. Flitman, personal communication, 1999.
I. Dion, M. Lahaye, R. Salmon, C. Baquey, J.R. Monties, P. Havlik, "Blood haemolysis by ceramics," Biomaterials 14(1993):107-110.
Дизайн сайта разработан KN Graphics
|
|