В.Н. Анисимов

"Молекулярные и физиологические механизмы старения"

6.2. Методы получения трансгенных мышей

Трансгенные животные - это животные, несущие фрагмент чужеродной ДНК, устойчиво интегрированный в геном организма, или имеющие часть удаленного или видоизмененного генома. При этом полученные генетические изменения устойчиво передаются потомкам. Первое сообщение, описывающее методику получения трансгенных мышей, было опубликовано в 1980 г. (Turrens, Boveris, 1996). В последние годы трансгенные мыши широко используются для изучения различных биомедицинских проблем (Кnарр, Корchick 1994; Anisimov, 2001c; Wagner, Sierra, 2003). Существует два основных экспериментальных подхода, в рамках которых трансгенные мыши могут быть использованы для изучения старения: 1) приобретение функции и 2) уменьшение или потеря функции.

Трансгенных мышей обычно получают с помощью трех методических приемов (Hogan et al., 1994). Наиболее простой и широко используемый - метод микроинъекции экзогенной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку. Оплодотворенная яйцеклетка перемещается к маточной трубе псевдобеременных самок и развивается в ней. Интродукция экзогенной ДНК в геном оплодотворенной яйцеклетки, как полагают, происходит при обычном процессе расщепления и репарации хромосом, происходящем в геноме случайным образом. При этом методе создания трансгенных мышей важно, чтобы, несмотря на случайный характер процесса интеграции, экзогенная ДНК была интегрирована в геном всех клеток в организме, особенно половых клеток. Когда интегрирование происходит на более поздних стадиях эмбрионального развития, получают мозаичных животных, в которых экзогенная ДНК определяет специфичность развития отдельных клеточных образований или клеточных пулов.

Трансгенные мыши также могут быть получены инфицированием на ранней стадии эмбрионов рекомбинантным ретровирусным геном. Этот метод имеет преимущество только в том случае, когда одна копия провируса проявляется при хромосомной интеграции сайтов. Эта методика имеет несколько ограничений. Например, ретровирус не может равномерно инфицировать все клетки на ранних стадиях развития эмбрионов, поэтому частота трансфекции вируса относительно низка. Кроме того, экспрессия генов, введенных в ретровирусный вектор, довольно низка, и только относительно малый фрагмент ДНК (меньше 10 тысяч пар оснований) может быть клонирован в ретровирусный вектор.

Третий метод для получения трансгенных мышей имеет ряд преимуществ благодаря плюрипотентности эмбриональных клеток линии ES. При этом клетки ES в культуре модифицируются с помощью обычного метода введения гена, и модифицированные клетки повторно вводятся в ранние бластоцисты, которые пересаживаются псевдобеременным самкам. Модифицированные ES клетки способствуют развитию химерного потомства; можно получить химерных мышей, в которых клетки ES вносят вклад в зародышевую линию. Этот метод позволяет исследователю отбирать in vitro желательный генотип или фенотип ES клеток. Указанный метод используется преимущественно для получения трансгенных конструкций, несущих мутацию в специфичном гене. Эти мутации могут инактивировать ген или изменять функцию белка. Метод имеет некоторые преимущества при сравнении с другими, хотя следует отметить, что получение культуры клеток и обеспечение полной плюрипотентности ES клеток технически довольно сложно.

 


Дизайн сайта разработан KN Graphics