3.3. Апоптоз и продолжительность жизни

Установление роли соматических мутаций и репарации ДНК в механизмах старения ставит вопрос об их непосредственной связи с процессами дифференцировки и программированной клеточной гибели (апоптоз) и злокачественного роста. Если у одноклеточных организмов лишь репарация повреждений ДНК позволяет им выжить при изменении условий окружающей среды, то у Metazoa оптимальная стратегия в отношении клеток, несущих повреждения ДНК, не столь однозначна, поскольку некоторые мутации в генах, регулирующих клеточную пролиферацию, адгезию и апоптоз, могут приводить к развитию злокачественных новообразований, ведущих к гибели организма. Поэтому для организма в целом "безопаснее" иметь механизмы элиминации таких генетически поврежденных клеток, чем риск возникновения очагов неконтролируемого автономного роста. Выбор конкретной "стратегии" организма - репарации ДНК, блокады пролиферации или апоптоза, зависит, во многом, от типа клеток, их локализации, микроокружения, характера повреждающего фактора и степени повреждения. В любом случае эффективный ответ на повреждение ДНК является ключевым звеном для выживания многоклеточного организма.

Еще в 1982 г. С. Р. Уманский высказал предположение, что старение может быть следствием плейотропного действия генов, ответственных за реализацию программированной клеточной гибели (апоптоза). Проявление активности этих генов приводит к постепенной убыли так называемых "критических" популяций клеток (в первую очередь клеток нервной системы), что, в сущности, и ведет к проявлению многих сторон старения (Уманский, 1982). Другую точку зрения на роль апотоза в старении высказали R. A. Lokshin и Z. F. Zakeri (1990), полагавшие, что снижение жизнеспособности организмов является результатом самодеструкции клеток, индуцируемой различными факторами окружающей среды.

Считается, что участие апоптоза в процессе старения может реализоваться двумя способами, причем, если первый, заключающийся в элиминации посредством апоптоза поврежденных стареющих клеток, которые впоследствии могут быть заменены путем клеточной пролиферации, обеспечивает сохранение тканевого гомеостаза, то второй, при котором удаляются постмитотические клетки, которые не могут быть возобновлены (например, кардиомиоциты, нейроны), приводит к развитию патологии (Warner, 1997).

В. П. Скулачевым (Скулачев, 1997; Skulachev, 1999, 2001, 2002) высказано предположение, что механизм, аналогичный апоптозу и названный им "митоптозом", реализуется на субклеточном уровне и касается, в частности, элиминации митохондрий, продуцирующих избыточное количество супероксида. Подобно этому запрограммированную смерть организмов предлагается обозначать термином "феноптоз". Феноптоз элиминирует из популяции наиболее уязвимых индивидуумов, что эволюционно оправдано, так как "расчищает место" для наиболее устойчивых и тем самым повышает эволюционный потенциал вида. Старение, согласно развиваемой концепции, является более мягким типом феноптоза (растянутым во времени и допускающим некоторую степень компенсации), чем острый феноптоз. Примерим последнего может служить гибель лосося немедленно после оплодотворения икры.

В последние годы достигнут значительный прогресс как в изучении самого феномена программированной клеточной гибели (апоптоза), так и в понимании молекулярных механизмов его реализации и регуляции (Пальцев, 1999; Хансон, 1999; Зайнуллин, Москалев, 2001; Green, Evan, 2002; Zhang, Herman, 2002; Scorrano et al., 2003). Установлена ключевая роль антионкогена р53 в этом процессе. Опосредованная р53 остановка пролиферации в стадии G1 или G2 клеточного цикла необратима. Такая клетка хотя и не погибает, но генетически она уже "мертва", поскольку не способна к развитию опухоли. Реализации такого эффекта р53 предшествует индукция циклин-зависимого ингибитора киназы р21. Менее ясна роль р53 в стимуляции собственно апоптоза. Установлено, что мишенями для р53 являются несколько специфических генов, таких как антагонист гена Bax ген Всl2, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), связывающий белок IGF-BP3, компоненты ренин-ангиотензин конвертирующей системы и белки, регулирующие ангиогенез (Evan, Littlewood, 1998). Более того, в некоторых случаях показано участие в этом процессе трансэкспрессии генов антиапоптоза и даже некоторых нетранскрипционных механизмов. Выявлено также, что р53 участвует в реакции клетки на воздействия, которые не повреждают непосредственно ДНК, например при метаболической депривации, физических травмах, тепловом шоке, гипоксии и экспрессии таких онкогенов как Мус и Е1А. Экспрессия многих генов, участвующих в контроле апоптоза, с возрастом повышается, тогда как некоторых уменьшается (табл. 22).

Выше уже обсуждалась модель клеточного старения Хейфлика и роль теломер и теломеразы в продолжительности жизни клеток in vitro. Использование этой модели оказалось весьма плодотворным для изучения механизмов репликативного старения. Прекращение способности клеток пролифериривать в культуре можно объяснить потерей экспрессии пострепликативных генов, например репрессией c-myc, или неспособностью белка ретинобластомы (RB) фосфорилироваться, или, напротив, увеличением экспрессии антирепликативных генов, например ингибитора циклинзависимой киназы (cdk) p21. Было установлено, что находящиеся в фазе репликативного старения фибробласты человека резистентны к апоптозу (Wang, 1995). Угнетение экспрессии ключевых генов G1 фазы, удерживающих стареющие фибробласты человека от вступления в фазу S клеточного цикла, по-видимому, является тем механизмом, который запускает процесс клеточной гибели. Уровень антиапоптотического фактора Bсl2 постоянно высок в таких клетках, при этом не наблюдается протеолиза терминина от формы 90 kDa до 30 kDa. Таким образом, репрессия генов G1 фазы, увеличение экспрессии гена антиапоптоза Bсl2 и отсутствие протеолиза представляется, по образному выражению Е. Wang (1997), крепким "тройным замком", который предотвращает апоптотическую гибель стареющих фибробластов.

Закономерен вопрос, имеют ли отношение эти результаты, полученные в опытах in vitro, к реальной ситуации старения in vivo, прежде всего к старению кожи человека? Было установлено, что в коже пожилых лиц в большом количестве содержатся стареющие фибробласты (Dimri et al., 1995). Хорошо известна высокая чувствительность кожи пожилых к канцерогенному действию ультрафиолета и сниженная способность к заживлению ран (Anisimov, 1998). Следует заметить, что еще в 1985 г. P. Ebbesen выявил существенное повышение чувствительности старых мышей к действию промотора кожного канцерогенеза 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) по сравнению с кожей молодых животных. При подкожном введении старым животным самых разнообразных канцерогенных агентов (полициклических ароматических углеводородов, нитрозосоединений, пластмассовых пленок или вируса Молони) саркомы на месте введения развивались с большей частотой и значительно раньше, чем у молодых (Anisimov, 1987, 1998, 2003). С другой стороны, стимуляция апоптоза в клетках печени ограничением калорийности питания угнетала развитие пренеопластических узелков в печени у старых крыс и мышей (Grasl-Kraupp et al., 1994; Muskhelishvili et al., 1996).

Таким образом, накопление в тканях с возрастом резистентных к апоптозу стареющих клеток, возможно, является тем айсбергом, который аккумулирует множественные повреждения, приводящие в конечном счете к неоплазии, нейродегенеративным процессам или вторичной смерти вследствие инфаркта миокарда (Anisimov, 1998; Wang, 1997; Green, Evan, 2002; Zhang, Herman, 2002). Подчеркивается, что, поскольку молекулярные повреждения, накапливающиеся при старении, обусловливают широкий спектр нарушений выживаемости клеток, они могут проявляться далеко не одинаково в разных органах и тканях. Действительно, в тех тканях, в которых стволовые клетки практически отсутствуют или содержатся в незначительном количестве, например в головном мозге, наблюдается возрастное снижение чувствительности к апоптозу. В органах, сформированных из обратимо дифференцированных клеток, таких как печень и сердце, напротив, сохраняется высокая способность отвечать на апоптотические сигналы, например при окислительном стрессе.

В. Г. Зайнуллин и А. А. Москалев (2001), рассматривая вопрос о возрастной дисрегуляции апоптоза, выделяют три блока: ядерный, митохондриальный и экзогенный (межклеточный). Возрастные изменения экспрессии и активности различных ДНКаз апоптоза, транскрипционного фактора р53, а также индуцируемых или репрессируемых им регуляторных белков, которые принимают участие в реализации апоптоза (катепсин, р21, IGF ВР-3, Вах и Всl-2), составляют ядерный механизм, который тесным образом связан с митохондриальным, поскольку осуществляющие его белки (Вах и Всl-2), а также продукция активных форм кислорода (АКФ) контролируются фактором р53. Межклеточный механизм включает уменьшение в непосредственном микроокружении клетки факторов гормональной и цитокиновой природы, необходимых для ее выживания, и, напротив, повышение концентрации лигандов так называемых "рецепторов гибели" (Fas-рецептора, рецептора фактора некроза опухолей TNF-R1, рецепторов -амилоидного пептида). Очевидно, что межклеточный механизм также связан с ядерным, поскольку индуцируемый р53 связывающий инсулинподобный фактор роста белок IGF ВР-3 способен связывать и инактивировать во внеклеточном пространстве цитокины, стимулирующие рост и выживание клетки. Авторы полагают, что апоптоз, наряду с генетической нестабильностью, накоплением ошибок синтеза и клеточно-тканевыми повреждениями, является одним из центральных механизмов старения целостного организма.

При использовании ионизирующего излучения в качестве повреждающего фактора было установлено, что при этом индуцируются не только механизмы нестабильности, но и репарации, антиоксидантной защиты. В результате продолжительность жизни может даже увеличиваться, поскольку при преобладании факторов антистарения система переходит на более высокий уровень защиты от повреждения и становится более устойчивой, чем до воздействия (Зайнуллин, Москалев, 2000, 2001). Проведенные исследования подтверждают участие процессов генетической нестабильности и апоптоза в старении организма. В частности, было установлено, что у линий, характеризующихся отличиями в паттерне мобильных генетических элементов, обнаружена разная реакция на облучение: к пятому поколению наблюдается уменьшение продолжительности жизни у линий дикого типа GB-39 и Canton-S по сравнению с контролем, тогда как у линии Oregon-R продолжительность жизни возрастает. Обработка индуктором апоптоза этопозидом на предимагинальных стадиях линий с дефектами репарации и апоптоза mei-41^D5, wg^1-7. vvg^7L74, th¹ и P1106 (несет дефект каспазы Dcp-1) приводит к снижению продолжительности жизни. Авторами впервые обнаружен доминантный эффект гена mei-41^D5 в регуляции этопозид-индуцированного изменения продолжительности жизни дрозофилы. Интересно, что у линии 1576, характеризующейся недостатком активности проапоптозного гена reaper, продолжительность жизни после воздействия как ионизирующего облучения, так и индуктора апоптоза этопозида, достоверна увеличивается по сравнению с контролем. У линии th¹, несущей дефект белка ингибитора апоптоза (DIAP-1), было отмечено снижение продолжительности жизни после воздействия. Такой же эффект наблюдали и у линии Р1106, имеющей сверхэкспрессию гена протеазы апоптоза dcp-1.

В другой серии экспериментов В. Г. Зайнуллин и А. А. Москалев (2001) изучали связь индуцированного апоптоза в нервной системе личинок дрозофилы со старением имаго. Для изучения скорости старения исследуемых линий после воздействия и в контроле оценивали возраст-зависимую динамику нервно-мышечной активности имаго, применив тест на отрицательный геотаксис. Для оценки использовали линии дрозофилы с повышенной чувствительностью к индукции апоптоза, с пониженной чувствительностью к индукции апоптоза и линию дикого типа Berlin. Для всех линий во всех вариантах эксперимента наблюдали тенденцию к снижению показателя нервно-мышечной активности с возрастом, что еще раз говорит о корреляции данного признака со старением.

Облучение линий с повышенной чувствительностью к индукции апоптоза, несущих мутацию гена th (аллели th¹ и th⁴), и линии дикого типа Berlin привело к увеличению нервно-мышечной активности на протяжении всего периода жизни имаго и соответственно к уменьшению скорости старения. У линий с пониженной чувствительностью к апоптозу - с делецией rpr, grim и hid, с нарушением функции проаптозного гена dArk^k11502, с мутациями гена протеазы апоптоза Dcp-1 (Dcp-1⁰²¹³² и Dcp-1^k05606) достоверных изменений нервно-мышечной активности после облучения выявлено не было. Используя принципиально новый подход к изучению

роли апоптоза в старении - воздейсгвие на предимагинальные стадии, авторы наблюдали отдаленную роль индукции апоптоза на скорость старения. Опираясь на вышеизложенные результаты, а также на факт существенного повышения уровня апоптоза в нервной системе личинок после облучения (увеличение уровня апоптоза в 2.5 раза), было выдвинуто следующее предположение. Не исключено, что любая ткань включает разнородные по чувствительности к повреждению клетки. Одни клетки обладают более мощной системой репарации и антиоксидантной защиты, тогда как другие - гораздо более слабой (например, вследствие соматических мутаций соответствующих генов)- Вероятно, что клетки с ослабленной защитой будут накапливать повреждения и подвергаться старению с большей скоростью, чем устойчивые- Большое количество таких потенциально опасных клеток в ткани будет определять преждевременное или ускоренное протекание возраст-зависимых дегенеративных и атрофических изменений. Однако в тканях с повышенной чувствительностью к индукции апоптоза (у линий /А1 и thA) воздействие радиации на предимагинальной стадии будет приводить к элиминации клеток с ослабленной защитой, что отсрочит возраст-зависимые изменения у имаго. У линии дикого типа Berlin также наблюдалось снижение скорости старения после облучения, однако значительно менее выраженное, чем у линий с повышенной чувствительностью к апоптозу. У четырех исследованных линий со сниженной чувствительностью к индукции апоптоза статистически значимого изменения скорости старения после облучения по сравнению с контролем В. Г. Зайнуллин и А. А. Москалев (2000, 2001а) не наблюдали, то есть можно предположить, что у нечувствительных к апоптозу линий предложенный механизм не функционирует. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что индуцированный на предимагинальных стадиях апоптоз может выступать в роли своеобразного механизма антистарения, элиминирующего потенциально опасные клетки с ослабленной системой репарации или антиоксидантной защиты. В связи с полученными фактами авторы ставят три важных вопроса, требующие углубленного исследования.

- Наблюдаются ли отмеченные эффекты при облучении в других (меньших или больших) дозах или при воздействии химических

индукторов апоптоза?

- Проявляются ли они у других, не постмитотических, возобновляемых тканях?

- Возможны ли они у не постмитотических организмов (например, млекопитающих)?

Авторы подчеркивают, что клетки, предрасположенные к накоплению повреждений, могут не только ускоренно стареть, приводя к атрофическим изменениям в тканях, но и малигнизироваться.

Предполагается, что нормальные (гомеостатические) апоптотические процессы могут непосредственно индуцировать старческий фенотип и связанную с возрастом патологию (Campisi, 2003). Как уже упоминалось выше, в норме апоптоз удаляет поврежденные клетки, и этот механизм у млекопитающих является важнейшим для защиты организма от рака. Однако апоптоз может развиваться в постмитотических клетках, например нейронах, поврежденных АКФ, некоторыми нейромедиаторами или токсическими агентами. Удаление апоптозом поврежденных нейронов в молодом возрасте может иметь лишь незначительные последствия или вообще не влиять на молодой организм, синаптическая пластичность которого позволяет нервной системе компенсировать случайную потерю нейронов (Finch, 2002). В старом организме, однако, апоптотическая убыль нейронов может превышать возможности оставшихся нейронов к компенсаторному восстановлению синаптических связей, что в конечном счете лежит в основе нейрональной недостаточности и нейродегенеративных заболеваний.

Дизайн сайта разработан KN Graphics